Петрозаводский государственный университет

О Б М Е Н В Е Щ Е С Т В

Методические указания

к лабораторным работам по биологической химии

для студентов 2 курса медицинского факультета

Петрозаводск 2002

Рассмотрены и утверждены к печати на заседании редакционной комиссии по отрасли науки и технологии «биология»

Печатаются по решению редакционно-издательского совета

Петрозаводского государственного университета
Составители

М. Н. Яковлева, канд. биол. наук;

В. В. Осташкова, канд. биол. наук


Предисловие
Настоящие методические указания содержат лабораторные работы по разделу «Биохимия белков», выполняемые студентами 2-го курса медицинского факультета в процессе изучения биологической химии. На лабораторных занятиях студенты овладевают современными методами эксперимен-тальных исследований, закрепляют теоретические знания, полученные на лекциях, анализируют результаты. В каждой лабораторной работе излагаются принцип метода, ход эксперимента, советы по оформлению результатов и правила по технике безопасности.

Работа 1. Ознакомление с действием некоторых ферментов

Ферменты (энзимы) – простые и сложные белки, катализи-рующие определенные химические реакции в организме. Так, амилаза слюны катализирует гидролиз -1,4-глюкозидных связей крахмала и гликогена, что приводит к образованию декстринов, а затем мальтозы. Панкреатическая липаза превра-щает ацилглицерины в глицерол и жирные кислоты. Фермент желудочного сока пепсин ускоряет гидролитический распад белков до пептидов. Каталаза расщепляет пероксид водорода на воду и молекулярный кислород. Тирозиназа катализирует превращение тирозина в пигмент меланин.

При ознакомлении с действием фермента сравнивают результаты энзиматической реакции с контрольными пробами, полученными в отсутствие фермента.
1. Ознакомление с действием амилазы слюны

Ход работы. В две пробирки наливают по 5 мл 0,2%-го раствора крахмала, в одну из них добавляют 0,5 мл слюны, а в другую (контроль) – 0,5 мл дистиллированной воды. Содер-жимое каждой пробирки перемешивают и пробы помещают в термостат при 37 оС на 15 минут. Затем в обе пробирки добав-ляют по 1-2 капли раствора Люголя (раствор йода в KJ). В контрольной пробирке появляется синее окрашивание, а в опытной (с амилазой слюны) такая окраска не развивается.
2. Ознакомление с действием липазы

Ход работы. В две пробирки наливают по 4 мл дистил-лированной воды, 5 мл 1%-го раствора бикарбоната натрия и 1 мл растительного масла. Содержимое пробирок энергично встряхивают до образования эмульсии и в обе пробирки добавляют по 3 капли 0,5%-го спиртового раствора фенол-фталеина. Затем в одну пробирку приливают 1 мл раствора липазы, а в другую (контроль) – 1 мл дистиллированной воды. Содержимое снова энергично встряхивают и пробирки ставят в термостат при 37 оС на 15-20 минут. В пробирке с липазой раствор становится менее окрашенным или обесцвечивается, в контрольной – остается розовым.
3. Ознакомление с действием пепсина

Ход работы. В две пробирки наливают по 2 мл 1%-го раствора альбумина и денатурируют его нагреванием. Пробирки охлаждают до комнатной температуры, а затем в одну из них добавляют 1 мл раствора пепсина, а в другую (контроль) – 1 мл дистиллированной воды. Обе пробы помещают в термостат при 37 оС на 15 минут. В пробирке с ферментом муть исчезает.
4. Ознакомление с действием каталазы

Ход работы. В две пробирки наливают по 5 мл свежеприго-товленного 5%-го раствора перекиси водорода и в одну из них добавляют 1 каплю крови, в которой содержится фермент каталаза. В пробирке с каталазой наблюдается интенсивное выделение пузырьков кислорода.
5. Ознакомление с действием тирозиназы

Ход работы.

а) Приготовление препарата тирозиназы

10 г измельченного картофеля тщательно растирают в фарфоровой ступке, постепенно прибавляя 30 мл дистиллиро-ванной воды. Полученную гомогенную смесь отжимают через 3-4 слоя марли.

б) Исследование действия ферментов

В две пробирки (опыт и контроль) наливают по 2 мл свеже-приготовленного препарата тирозиназы. Содержимое контроль-ной пробирки кипятят в течение 3 минут и охлаждают. Затем в обе пробирки прибавляют по 1 мл насыщенного раствора тиро-зина. Содержимое каждой пробирки перемешивают, и пробы помещают в термостат при 37 оС на 60 минут. Через каждые 5 минут пробирки встряхивают для лучшего соприкосновения жидкости с воздухом. В опытной пробирке смесь постепенно окрашивается в розовый, красно-бурый и затем черный цвет.
Оформление работы

Запишите результаты опытов. Объясните причину измене-ний в пробах, содержащих ферменты.
Техника безопасности

  • Соблюдайте правила техники безопасности при работе с электронагревательными приборами.

  • Будьте внимательны при пользовании спиртовкой.

  • Осторожно обращайтесь с 5%-м раствором перекиси водорода.



Работа 2. Специфичность действия ферментов

Одним из свойств ферментов является специфичность их действия. Ферменты специфичны по отношению к типу катализируемой реакции и к субстрату, на который они действуют. Высокая специфичность ферментов определяется тем, что только строго определенные функциональные группы активного центра фермента участвуют в образовании фермент- субстратного комплекса.
1. Специфичность действия амилазы

Ход работы. В две пробирки вносят по 0,5 мл слюны и в одну из них добавляют 2 мл 0,5%-го раствора крахмала, а в другую – 2 мл 0,5%-го раствора сахарозы. Содержимое каждой пробирки перемешивают стеклянной палочкой, и пробы поме-щают в термостат при 37 оС на 20 минут. Затем в обе пробирки добавляют по 2 мл 10%-го раствора гидроксида натрия, по 0,5 мл 5%-го раствора сульфата меди и после перемешивания нагревают до кипения. В пробирке, содержащей крахмал, выпадает красный или желтый осадок (положительная проба Троммера).

2. Специфичность действия сахаразы дрожжей

Ход работы

1. Для разрушения дрожжевых клеток 0,5 г пекарских дрожжей тщательно растирают в фарфоровой ступке, добавив немного стеклянного песка. Затем продолжают растирание, постепенно приливая 3-5 мл дистиллированной воды, при этом дрожжевая сахараза переходит в раствор. Смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр, и полученный фильтрат используют как источник сахаразы.

2. В две пробирки наливают по 1 мл фильтрата, в одну из них добавляют 2 мл 0,5%-го раствора сахарозы, а в другую – 2 мл 0,5%-го раствора крахмала. Содержимое каждой пробы перемешивают стеклянной палочкой, после чего пробирки выдерживают в термостате при 37 оС в течение 15 минут. Затем в обе пробирки вносят по 2 мл 10%-го раствора гидроксида натрия, 0,5 мл 5%-го раствора сульфата меди и нагревают до кипения. В пробирке, содержавшей сахарозу, проба Троммера положительная.
3. Специфичность действия уреазы

Уреаза – фермент, обладающий абсолютной специфич-ностью действия, расщепляет мочевину на аммиак и углекислый газ:

2 уреаза

С = О + Н2О  2 NН3 + СО2.

2
Ход работы. В две пробирки наливают по 5 мл раствора уреазы и по 5 капель 1%-го спиртового раствора фенолфта-леина. В одну пробирку добавляют 1 мл 5%-го раствора моче-вины, а в другую – 1 мл 5%-го раствора тиомочевины. Содержимое пробирок перемешивают, и пробы оставляют на 20 минут при комнатной температуре. Раствор в пробирке с моче-виной окрашивается в розовый цвет вследствие образования гидроксида аммония при выделении аммиака. Аммиак в этой пробирке можно обнаружить и по запаху. Тиомочевина под действием уреазы не расщепляется, поэтому раствор во второй пробирке не окрашивается.
Оформление работы

Запишите полученные результаты и выводы в форме таблицы.


Фермент

Субстрат

Проба Троммера

Вывод














Техника безопасности

  • Соблюдайте правила пользования электронагревательными приборами.

  • Будьте внимательны при нагревании растворов на спиртовке.

  • Осторожно обращайтесь с 10%-м раствором щелочи натрия.



Работа 3. Зависимость каталитической активности ферментов от температуры и реакции среды

Скорость ферментативных реакций зависит от температуры и концентраций водородных ионов в среде. Каждый фермент имеет свой оптимум рН и температуры, при которых активность фермента максимальна.
1. Влияние температуры на активность амилазы слюны

Ход работы. В четыре пробирки наливают по 0,5 мл 0,5%-го раствора крахмала, в другие четыре – по 0,5 мл слюны, разве-денной в 10 раз.

Берут первую пару пробирок (одна с крахмалом, а вторая со слюной, содержащей амилазу) и помещают их в раздробленный лед; вторую пару – оставляют при комнатной температуре, третью пару – помещают в термостат (37 оС), а четвертую – в кипящую водяную баню.

Через 10 минут содержимое каждой пары пробирок сливают вместе, тщательно перемешивают и оставляют стоять еще 10 минут при прежних условиях.

Затем из пробирки, стоящей в термостате, отбирают на часовое стекло 3 капли жидкости и добавляют 1 каплю раствора Люголя. Если появляется синее окрашивание, то все пробы выдерживают в разных температурных условиях еще 10 минут, после чего во все четыре пробирки добавляют по 2 капли раствора Люголя и наблюдают за появляющейся окраской.

Если на часовом стекле появляется желто-коричневая окраска, то реакцию с раствором Люголя проводят во всех пробирках сразу же.
2. Определение оптимума рН для амилазы слюны

Ход работы. Перед началом работы готовят раствор амилазы. Для этого смешивают 1 мл 1%-го раствора крахмала и 0,5 мл слюны, разбавленной в 10 раз. Через каждые 2 минуты отбирают на предметное стекло по 1 капле этой смеси и добавляют к ней 1 каплю раствора Люголя. Крахмал должен полностью расщепиться за 10 минут (желтая окраска пробы с йодом). Если расщепление крахмала происходит быстрее, слюну надо развести еще в 2-4 раза; если медленнее – уменьшить начальное разведение.

В восемь пронумерованных пробирок наливают по 2 мл фосфатного буфера соответственно с рН: 5,4; 5,8; 6,2; 6,6; 6,8; 7,0; 7,4; 8,0. Во все пробирки добавляют по 5 мл 0,2%-го раствора крахмала (приготовленного на 0,1%-м растворе NаС1) и по 1 мл разбавленной слюны. Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают стеклянной палочкой, после чего пробирки помещают в термостат при 37 оС. Через каждые 3 минуты 1 каплю жидкости, взятой из пятой пробирки, смешивают на предметном стекле с 1 каплей раствора Люголя. Вначале при смешивании образуется синее окрашивание, затем фиолетовое, фиолетово-красное. Как только проба из пятой пробирки даст с йодом на предметном стекле красно-бурое окрашивание, все пробирки извлекают из термостата, охлаж-дают под струей холодной воды и добавляют по 2 капли раствора Люголя. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и сравнивают окрашивание.

Оформление работы

Результаты изучения влияния температуры на активность фермента записать в таблицу и отметить температурный оптимум:


№ пробы

Температура инкубации (оС)

Окраска

Температурный оптимум















Результаты изучения влияния реакции среды на активность амилазы слюны занести в таблицу и отметить оптимальное значение рН для действия амилазы:


№ пробы

























РН

























Окрашивание с йодом



























Техника безопасности

  • Будьте внимательны и осторожны, работая с кипящей водяной баней.

  • Соблюдайте правила работы с электронагревательными приборами.


Работа 4. Количественное определение активности каталазы в крови по методу Баха и Зубковой

Фермент каталаза – гемсодержащий хромопротеид, катали-зирующий реакцию разложения перекиси водорода:
каталаза

2О2  О2 + 2Н2О.
Этот фермент содержится во всех тканях и жидкостях организма, но особенно много его в строме эритроцитов и печени. Биологическая роль каталазы заключается в обезвре-живании перекиси водорода – ядовитого конечного продукта некоторых окислительно-восстановительных процессов.

При количественном определении активности каталазы обычно устанавливают количество перекиси водорода, расщеп-ленного ферментом. Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа и показателя каталазы. Каталазным числом называют количество миллиграммов перекиси водорода, кото-рое разлагается каталазой, содержащейся в 1 мкл крови. Показа-тель каталазы – это отношение каталазного числа к количеству эритроцитов (в миллионах) в 1 мкл исследуемой крови.

Метод количественного определения активности каталазы, предложенный А. Н. Бахом и В. С. Зубковой, основан на титро-вании перекиси водорода, оставшейся нерасщепленной после действия фермента, перманганатом калия в кислой среде:
2О2 + 2КмпО4 + 4Н24  2КНSО4 + 2МпSО4 + 8Н2О +5О2.
Ход работы. Свежую кровь разбавляют дистиллированной водой в 1000 раз. Для этого в мерную колбу на 100 мл наливают 20-30 мл дистиллированной Н2О и осторожно вносят в воду 0,1 мл крови, набранной микропипеткой. Микропипетку несколько раз промывают верхним слоем воды, набирая и выпуская ее в колбу. Затем в мерную колбу доливают дистиллированную воду до метки и содержимое перемешивают. В 1 мл полученного раствора содержится 1 мкл крови.

В две конические колбы (опытную и контрольную) наливают по 7 мл дистиллированной воды и 1 мл раствора крови. В контрольную колбу для инактивации каталазы добав-ляют 3 мл 10%-го раствора серной кислоты. Затем в обе колбы приливают по 10 мл 0,1%-го раствора перекиси водорода, приготовленного на фосфатном буфере (рН=7,0), перемешивают и колбы оставляют на 30 минут при комнатной температуре, после чего прекращают действие фермента в опытной колбе добавлением в нее 3 мл 10%-го раствора Н24. Содержимое колб титруют из бюретки 0,01 н раствором перманганата калия до появления не исчезающего розового окрашивания.
Оформление работы

Запишите результаты титрования опытной и контрольной колб и рассчитайте каталазное число по формуле:

КЧ = (В – А)  0,17  f ,

где КЧ – каталазное число;

А – количество 0,01 н раствора перманганата калия (мл), пошедшее на титрование опытной колбы;

В – количество 0,01 н раствора КMnО4 (мл), пошедшее на титрование контрольной колбы;

f – коэффициент нормальности (поправочный коэффициент) используемого раствора перманганата калия;

0,17 – количество миллиграммов перекиси водорода, соот-ветствующего 1 мл 0,01 н раствора перманганата калия. Это количество легко рассчитать, учитывая, что 1 мл 0,01 н КMnО4 эквивалентен 1 мл 0,01 н Н2О2; 1 грамм-эквивалент Н2О2 равен 17 г, поэтому 1 мл 0,01 н Н2О2 содержит 0,17 мг Н2О2.

Сравните полученный результат с нормой.

Каталазное число крови здорового человека колеблется в пределах 10 – 15. Содержание каталазы в крови снижается при анемии, туберкулезе, злокачественных опухолях.
Техника безопасности

  • Осторожно обращаться с 10%-м раствором серной кислоты.

  • Избегать попадания в глаза раствора перманганата калия.



Работа 5. Качественные реакции на витамины

Витамины  низкомолекулярные органические вещества, имеющие разнообразную химическую структуру. Почти все витамины не синтезируются в организме человека и относятся к незаменимым пищевым факторам.

Витамины отличаются от всех других органических веществ пищи двумя признаками: они не входят в состав структуры органов и тканей и не используются организмом в качестве источника энергии. Отсутствие или недостаточное содержание витаминов в пище приводит к развитию тяжелых заболеваний. Нарушение обмена веществ при авитаминозах и гиповита-минозах является следствием снижения активности ферментов, поскольку многие витамины входят в состав простетических групп энзимов. Для обнаружения витаминов в пищевых продуктах, тканях и жидкостях организма и для определения их количества используются качественные реакции, основанные на образовании характерных окрашенных продуктов реакции витамина с каким-либо химическим реагентом.
А. Качественные реакции на водорастворимые витамины
1. Реакции на витамин В1 (тиамин)

а) Диазореакция на тиамин

При добавлении к раствору тиамина в щелочной среде диазо-реактива образуется сложное соединение этого витамина с диазобензолсульфокислотой, окрашенное в оранжевый или красный цвет. Диазобензолсульфокислота образуется в резуль-тате реакции диазотирования при взаимодействии сульфани-ловой кислоты с нитратом натрия (или калия):
SO3H SO3

 



NaNO2 H2O + Na+

 

NH2 + N  N

сульфаниловая диазобензолсульфоновая кислота кислота
Затем диазобензолсульфоновая кислота реагирует в щелочной среде с тиамином с образованием окрашенного азосоединения:

SO3



+  Na2CO3 NaHCO3

+ +

 H2O NaOH

+ N  N

тиамин диазобензол-

сульфоновая кислота




азосоединение оранжево-красного цвета

Ход работы. К диазореактиву, состоящему из 5 капель 1%-го раствора сульфаниловой кислоты и 5 капель 1%-го раствора нитрата натрия, прибавляют 1-2 капли 5%-го раствора тиамина и затем по стенке, наклонив пробирку, осторожно добавляют 5-7 капель 10%-го раствора карбоната натрия. На границе двух жидкостей образуется оранжево-красное кольцо.
б) Реакция окисления тиамина

В щелочной среде тиамины окисляются железосинеродистым калием (феррицианидом калия) с образованием окрашенного в желтый цвет тиохрома. Тиохром обладает синей флюорес-ценцией при ультрафиолетовом облучении раствора в флюо-роскопе, и это свойство используется при количественном определении тиамина.

+ 2K3Fe(CN)6 + 3KOH 

феррицианид

калия


тиаминхлорид
 + 2 K4Fe(CN)6 + KCl + 3 H2O

ферроцианид

калия

тиохром

Ход работы. 1 каплю 5%-го раствора тиамина смешивают в пробирке с 5-10 каплями 10%-го раствора гидроксида натрия и затем добавляют 1-2 капли раствора железосинеродистого калия. При нагревании жидкость окрашивается в желтый цвет вследствие окисления тиамина в тиохром.

2. Реакция восстановления витамина В2 (рибофлавина)

Окисленная форма рибофлавина  вещество желтого цвета, флюоресцирующее в ультрафиолетовых лучах. Витамин В2 легко восста-навливается через промежуточные соединения красного цвета (родо-флавин) в бесцветный лейкофлавин. Реакция обусловлена восстановлением рибофлавина водородом, образующимся при добавлении металлического цинка к соляной кислоте. При этом желтая окраска раствора переходит в розовую, затем раствор обесцвечивается. При взбалтывании обесцвеченного раствора лейкосоединение вновь окисляется кислородом воздуха в рибофлавин.



Zn +2HCl ZnCl2

рибофлавин лейкофлавин
Ход работы. В пробирку наливают 10 капель 0,025%-й взвеси рибофлавина в воде, добавляют 5 капель концентри-рованной соляной кислоты и небольшой кусочек металличес-кого цинка. Наблюдают бурное выделение пузырьков водорода и изменение окраски жидкости.
3. Реакции на витамин РР (никотиновую кислоту, никотинамид)

а) Реакция с ацетатом меди

При нагревании никотиновой кислоты с раствором уксуснокислой меди образуется плохо растворимый синий осадок медной соли витамина РР.

O

– COOH CH3  C O

2 +  Cu 

N CH3  C O

O

никотиновая кислота ацетат меди

O O

  

 C  O  Cu  O  C 

 + 2CH3COOH

N N


никотинат меди
Ход работы. 5-10 мг никотиновой кислоты растворяют при нагревании в 10-20 каплях 10%-го раствора уксусной кислоты. К нагретому до кипения раствору добавляют равный объем 5%-го раствора ацетата меди. Жидкость становится мутной, окрашивается в голубой цвет, а при стоянии выпадает синий осадок никотината меди.
б) Реакция обнаружения аминогруппы в никотинамиде

При нагревании в присутствии гидроксида натрия амидная связь в никотинамиде разрывается с выделением аммиака.

 CONH2  COONa



N NaOH NH3 N
никотинамид никотинат натрия
Ход работы. В пробирку помещают 5-10 мг порошка витамина РР, прибавляют 2 мл 0,1 М раствора гидроксида натрия и нагревают до кипения. Ощущают запах образующегося аммиака.

в) Реакция с гидросульфитом натрия

Витамин РР восстанавливается гидросульфитом натрия с образованием соединения желтого цвета.

Ход работы. В пробирку вносят 5-10 мг витамина РР, добавляют 1,5 мл 10%-го раствора бикарбоната натрия, перемешивают и прибавляют 1,5 мл свежеприготовленного 5%-го раствора гидросульфата натрия. Жидкость окрашивается в желтый цвет.
4. Реакции на витамин В6 (пиридоксин)

Активностью витамина В6 обладают три соединения, объединенных под названием “пиридоксин”:
CH2OH O = C  H CH2NH2

  

пиридоксол пиридоксаль пиридоксамин
а) Феррохлоридная проба на витамин В6.

При взаимодействии пиридоксина с хлорным железом образуется комплексная соль типа фенолята железа, окрашенная в красный цвет.

Ход работы. В пробирку наливают 1 мл 1%-го раствора витамина В6, добавляют 2 капли 1%-го раствора хлорида железа и содержимое встряхивают. Жидкость окрашивается в красный цвет.

б) Реакция осаждения витамина В6.

Пиридоксин, являясь производным пиридина, осаждается фосфорномолибденовой, пикриновой, фосфорновольфрамовой кислотами и другими реактивами на алкалоиды.

Ход работы. К 2-3 каплям 1%-го раствора витамина В6 добавляют 2-3 капли 1%-го раствора фосфорномолибденовой кислоты и наблюдают появление осадка.
5. Качественные реакции на витамин В12 (кобаламин)

В состав витамина В12 входит кобальт. В результате взаимо-действия ионов кобальта с тиомочевиной при нагревании образуется роданид кобальта зеленого цвета.

Ход работы

1. Содержимое одной ампулы с кобаламином переносят в пробирку, добавляют 3-5 капель концентрированной серной кислоты и нагревают до обесцвечивания в пламени спиртовки, установленной в вытяжном шкафу с включенной тягой. По окончании минерализации в пробирку осторожно, медленно, при постоянном перемешивании добавляют 1 мл дистилли-рованной воды.

2. На беззольный фильтр наносят 2-3 капли 10%-го раствора тиомочевины, осторожно высушивают над пламенем спиртовки. Затем наносят 1-2 капли минерализата В12 и осторожно нагре-вают фильтр над пламенем спиртовки. На фильтре, чаще ближе к краю, появляется зеленое окрашивание.
6. Качественные реакции на витамины группы Р (биофлавоноиды)

Витамины группы Р  производные флавона: рутин, эрио-диктиол, геспередин, кверцетин, эпикахетин и другие. Одним из наиболее активных биофлавоноидов является рутин  глико-зид кверцетина и дисахарида рутинозы:

Рутин
а) Реакция с хлоридом железа

Биофлавоноиды образуют с хлоридом железа комплексное соединение, окрашенное в изумрудно-зеленый цвет. Координа-ционные связи возникают между ионом железа и атомами кислорода фенольных гидроксильных групп молекулы витамина.

Ход работы. К 1-2 мл насыщенного водного раствора рутина прибавляют 3-5 капель 1%-го раствора хлорида железа (FeCl3). Появляется зеленое окрашивание.

б) Реакция с концентрированной серной кислотой

Концентрированная серная кислота образует с биофлаво-ноидами оксониевые (флавилиевые) соли, растворы которых характеризуются ярко-желтой окраской.

Ход работы. К 1-2 мл насыщенного водного раствора рутина осторожно по стенке пробирки добавляют 0,5-1 мл концентри-рованной серной кислоты. На границе двух жидкостей возникает окрашенное в желтый цвет кольцо.

в) Реакция Фелинга на рутин

При кислотном гидролизе рутина отщепляется молекула дисахарида рутинозы, которая затем распадается на глюкозу и рамнозу, обладающих восстанавливающими свойствами.

Ход работы. К 0,5 г порошка рутина приливают 5 мл 0,5%-го раствора соляной кислоты, нагревают при периодическом перемешивании до кипения и кипятят в течение 1 минуты. Пробирку охлаждают, и раствор фильтруют через бумажный фильтр. К фильтрату добавляют 3 мл 10%-го раствора гидроксида натрия и 3 мл свежеприготовленного реактива Фелинга (1,5 мл раствора Фелинга  и 1,5 мл раствора Фелинга ). Содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой, нагревают до кипения и наблюдают образование красного осадка оксида меди ().
7. Реакции на витамин С (аскорбиновую кислоту)

Все качественные реакции на аскорбиновую кислоту основаны на ее способности легко вступать в окислительно-восстановительные реакции. Окисляясь, аскорбиновая кислота превращается в дегидроаскорбиновую, восстанавливая различ-ные соединения:

окисление

 CHOHCH2OH  CHOHCH2OH

восстановление

аскорбиновая кислота дегидроаскорбиновая

кислота
а) Реакция восстановления феррицианида калия

витамином С

Аскорбиновая кислота в щелочной среде восстанавливает феррицианид калия (железосинеродистый калий) до ферроциа-нида калия (железистосинеродистого калия), который при взаимодействии с хлорным железом в кислой среде образует плохо растворимую в воде соль трехвалентного железа  берлинскую лазурь, выпадающую в осадок темно-синего цвета:
1. аскорбиновая + 2К3Fе(СN)6 + 2КОН  дегидро- + 2К4Fе(СN)6 + 2Н2О. кислота феррицианид аскорбиновая ферроцианид

калия кислота калия

2. 3К4Fе(СN)6 + 4FеС13  Fе4Fе(СN)63 + 12КСl.

ферроцианид берлинская

калия лазурь
Ход работы. В одну пробирку (опыт) вносят 5 капель 1%-го раствора витамина С, а в другую (контроль)  5 капель дистил-лированной воды. В обе пробирки добавляют по 1 капле 10%-го раствора гидроксида калия и 1 капле 5%-го раствора железо-инеродистого калия, перемешивают, после чего добавляют по 3 капли 10%-го раствора соляной кислоты и 1 капле 1%-го раствора хлорида железа. В опытной пробирке выпадает темно-синий осадок берлинской лазури, который при осторожном наслаивании воды становится более отчетливым.

б) Реакция восстановления метиленовой сини витамином С

Витамин С обесцвечивает раствор метиленовой сини, восста-навливая ее в лейкосоединение:


аскорбиновая + 

кислота

метиленовая синяя
 дегидроаскорбиновая + +HCl

кислота

лейкометиленовая

синяя
Ход работы. В двух пробирках (опыт и контроль) смешивают по 1 капле 0,01%-го раствора метиленовой сини и 1 капле 10% раствора бикарбоната натрия. В опытную пробирку добавляют 5 капель 1%-го раствора витамина С, а в контроль-ную  столько же дистиллированной воды. Нагревание раство-ров в пробирках приводит к обесцвечиванию жидкости в опытной пробе.

в) Йодная проба на витамин С

Раствор Люголя (раствор йода в йодиде калия) при добавлении к нему витамина С обесцвечивается вследствие восстановления молекулярного йода с образованием йодисто-водородной кислоты.
аскорбиновая  дегидроаскорбиновая

кислота J2 2HJ кислота
Ход работы. В две пробирки (опыт и контроль) наливают по 10 капель дистиллированной воды и 2 капли раствора Люголя. В опытную пробирку добавляют 5-10 капель 1%-го раствора аскорбиновой кислоты, в контрольную – столько же дистилли-рованной воды. В опытной пробирке раствор обесцвечивается.
г) Серебряная проба на витамин С

При добавлении витамина С к нитрату серебра выпадает в осадок в виде металлического серебра:
аскорбиновая + 2АgNО3  2Аg + 2НNО3 + дегидроаскорбиновая

кислота кислота
Ход работы. В две пробирки (опыт и контроль) вносят по 5 капель 1%-го раствора аскорбиновой кислоты; затем в опытную пробирку добавляют 1-2 капли 1%-го раствора азотно-кислого серебра, а в контрольную  1-2 капли дистиллирован-ной воды. В опытной пробе наблюдается появление темного осадка металлического серебра.
Б. Качественные реакции на жирорастворимые витамины

1. Реакции на витамин А

H3C CH3 CH3



 (CH = CH  C = CH)2  CH2OH
 CH3
витамин А1 (ретинол)
Качественные реакции на витамин А основаны на образовании окрашенных соединений сложной структуры.
а) Реакция Друммонда

В присутствии концентрированной серной кислоты ретинол обезвоживается с образованием цветных продуктов реакции.

Ход работы. В сухую пробирку вносят 1 каплю рыбьего жира и 4-5 капель хлороформа. Смесь хорошо перемешивают встряхиванием и добавляют 1 каплю концентрированной серной кислоты. Появляется сине-фиолетовое окрашивание, быстро переходящее в красно-бурое.
б) Реакция витамина А с сульфатом железа ()

При взаимодействии ретинола с FeSО4 в кислой среде образуется соединение розово-красного цвета. Каротины дают в этой реакции зеленоватое окрашивание.

Ход работы. К 1-2 каплям рыбьего жира осторожно (работают под тягой) прибавляют 5-10 капель насыщенного раствора сульфата железа (FeSO4, приготовленного на ледяной уксусной кислоте, и добавляют 1 каплю концентрированной серной кислоты. Появляется голубое окрашивание, постепенно переходящее в розово-красное.
в) Реакция витамина А с треххлористой сурьмой

В результате водоотнимающего действия хлорида сурьмы (SbCl3 витамин А превращается в соединение синего цвета. Эта цветная реакция используется для количественного определения витамина А колориметрическим методом.

Ход работы. В совершенно сухую пробирку помещают 1 каплю рыбьего жира и 4-5 капель насыщенного (33%-го) раствора хлорида сурьмы (III) в безводном хлороформе. Появляется синее окрашивание, которое постепенно переходит в розово-фиолетовое.

Внимание! Пробирка должна быть сухой, так как в присутствии воды реакция не идет из-за способности хлорида сурьмы (III превращаться в таких условиях в хлороксид сурьмы, который не может реагировать с ретинолом, вызывая помутнение раствора. Для устранения следов влаги в пробу можно добавить 1-2 капли уксусного ангидрида.
2. Реакция на витамин D

Среди витаминов группы D наиболее распространены эргокальциферол и холекальциферол.

эргокальциферол холекальциферол

(витамин D2) (витамин D3)
а) Анилиновая проба на витамин D

При нагревании рыбьего жира, содержащего витамин D, с анилиновым реактивом раствор приобретает красную окраску.

Ход работы. В сухую пробирку вносят 1 каплю рыбьего жира, 5 капель хлороформа и тщательно встряхивают. Затем добавляют 1 каплю анилинового реактива, содержащего 15 частей анилина и 1 часть концентрированной соляной кислоты. Смесь осторожно при помешивании нагревают до кипения и кипятят примерно 30 секунд. При наличии витамина D желтая эмульсия сначала становится зеленой, а затем красной. При стоянии эмульсия через 1-2 минуты расслаивается, при этом нижний слой окрашен в интенсивно красный цвет.
б) Бромхлороформенная проба на витамин D

При смешивании рыбьего жира, содержащего витамин D, с раствором брома в хлороформе смесь окрашивается в зеленовато-голубой цвет.

Ход работы. В сухой пробирке смешивают 2 капли рыбьего жира и 4 капли раствора брома в хлороформе (1:60). Смесь постепенно приобретает зеленовато-голубую окраску.
в) Реакция витамина D с хлоридом сурьмы (V)

При прибавлении к витамину D насыщенного раствора SbCl5 смесь окрашивается в желтый цвет.

Ход работы. В сухой пробирке смешивают 6-10 капель витамина D и 1,5 мл хлороформа, добавляют 0,2 мл насыщен-ного раствора хлорида сурьмы (V) и тщательно перемешивают. Наблюдают появление желтого окрашивания.
3. Реакция на витамин Е

Витамины группы Е (токоферолы) являются производными токола, самый активный из них  -токоферол. Качественные реакции на -токоферол обусловлены окислением его в -токо-ферилхинон, окрашенный в красный цвет.





-токоферол




-токоферилхинон
а) Реакция -токоферола с концентрированной азотной кислотой

При прибавлении к -токоферолу концентрированной азотной кислоты раствор окрашивается в оранжевый или красный цвет.
-токоферол  -токоферилхинон

НNО3 НNО2 (красного цвета)
Ход работы. В сухую пробирку вносят 5 капель 0,1%-го спиртового раствора -токоферола и 10 капель концентриро-ванной азотной кислоты. Содержимое пробирки встряхивают, появляется красное окрашивание. Если образовавшуюся окра-шенную эмульсию поместить в водяную баню при 70 оС, она расслаивается, при этом верхний масляный слой имеет красный цвет.
б) Реакция -токоферола с хлоридом железа (III

Добавление к -токоферолу хлорида железа (FeCl3) вызывает появление красной окраски .
-токоферол  -токоферилхинон

FеС13 + Н2О FеС12 + HCl (красного цвета)

Ход работы. 4-5 капель 0,1%-го спиртового раствора -токоферола смешивают с 0,5 мл 1%-го раствора хлорного железа. Смесь тщательно перемешивают и наблюдают появле-ние красного окрашивания.
4. Реакция на витамин К

Витамины группы К являются производными метилнафто-хинона. Высокой витаминной активностью обладает искус-ственно синтезированный аналог витамина К1 викасол.

2-метилнафтохинон викасол

(менадион)
а) Реакция с цистеином

Викасол в присутствии цистеина в щелочной среде окрашивается в желтый цвет.

Ход работы. В пробирку вносят 10 капель 0,1%-го спиртового раствора викасола, 5 капель 0,025%-го раствора цистеина и 2 капли 10%-го раствора гидроксида натрия. Содержимое пробирки перемешивают и наблюдают появление желтого окрашивания.

б) Реакция с анилином

При взаимодействии витамина К с анилином образуется соединение, окрашенной в красный цвет. Например:

2 + H2N – 


анилин
2-метил-1,4,-нафтохинон

(меладион)


 +


2-метил-3-фенил- 2-метил-1,4-дигидрокси-

амино-1,4-нафтохинон нафталин

(красный цвет)
Ход работы. В пробирку вносят 5 капель 0,2%-го спиртового раствора менадиона (приготовленного на этаноле), 2 капли анилина и перемешивают. Смесь окрашивается в красный цвет.
в) Реакция с диэтилмалоновым эфиром

Спиртовой раствор витамина К в щелочной среде с диэтил-малоновым эфиром дает красно-фиолетовое окрашивание.

Ход работы. В пробирку наливают 2 мл 0,1%-го спиртового раствора викасола, 0,5 мл 1%-го раствора диэтилмалонового эфира и 0,1 мл (2 капли) 1%-го раствора гидроксида калия. Развивается красно-фиолетовое окрашивание.
г) Реакция с диэтилдитиокарбаматом

Спиртовой раствор витамина К в щелочной среде в присут-ствии диэтилдитиокарбамата образует соединение, окрашенное в голубой цвет.

Ход работы. В пробирку наливают 2 мл 0,2%-го спиртового раствора менадиона, 2 мл 5%-го раствора диэтилдитиокарбамата и 0,5 мл 4%-го спиртового раствора гидроксида натрия. Содер-жимое пробирки перемешивают. Раствор приобретает голубое окрашивание.


Оформление работы

Результаты работы оформите в виде таблицы:

№ п/п

Название витамина

Химическая формула витамина

Используемые реактивы

Наблюдаемое окрашивание

Чем обуслов-лена реакция





















Техника безопасности

  • Категорически запрещается отмеривать концентрирован-ные кислоты и щелочи градуированными пипетками.

  • Будьте внимательны и осторожны при использовании концентрированных кислот (НСl, Н24, НNО3, СН3СООН) и щелочей (КОН, NаОН).

  • Осторожно обращайтесь с солями сурьмы и анилином.

  • В процессе нагревания постоянно перемешивайте жидкость, не допускайте выброса ее из пробирки.

  • Работу с легкоиспаряющимися растворителями и веществами с резким запахом проводите в вытяжном шкафу при включенной тяге.

  • Соблюдайте правила пожарной безопасности.


Работа 6. Количественное определение аскорбиновой кислоты методом Тильманса

Принцип метода. Метод основан на способности витамина С восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол:

O Cl

  

HO

HO + O= = N   ONa 

 HCl NaCl

HOCH 

 Cl

CH2OH 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия

аскорбиновая кислота (синего цвета)

O Cl

  

O=

  O + HO N OH

O= 

  H

HOCH Cl



CH2OH

дегидроаскорбиновая 2,6-дихлорфенолиндофенол

кислота (восстановленная бесцветная

форма)
2,6-дихлорфенолиндофенол (краска Тильманса) используется в данном методе не только как окислитель, но и как индикатор, по которому можно установить завершение титрования. В зависи-мости от рН среды 2,6-дихлорфенолиндофенол имеет разную окраску: в щелочной среде – синюю, в кислой – красную, а его лейкоформа – бесцветна:

Cl


1) O = = N – – ONa – синий


Cl
Cl



2) O = = N– – OH – красный



Cl

Cl



3) HO – – N– –OH – бесцветный



 H

Cl

При определении количества витамина С исследуемый раствор, подкисленный соляной кислотой, титруют 2,6-дихлор-фенолиндофенолятом натрия. Как только все количество вита-мина С, имеющееся в исследуемом растворе, окислится, раствор приобретает розовую окраску, характерную для 2,6-дихлор-фенолиндофенола в кислой среде.
1. Определение количества витамина С в пищевых продуктах и хвое

Аскорбиновая кислота не синтезируется в организме человека. Главным источником этого витамина являются свежие овощи и фрукты. В различных пищевых продуктах содержится следующее количество витамина С (в мг%):

Черная смородина – 100-400

Укроп – 120-135

Лимон – 40-55

Капуста (свежая и квашенная) – 30-40

Томаты – 20-40

Лук зеленый – 16-33

Яблоки северные – 20-40

Яблоки южные – 5-17

Смородина красная – 5-15

Картофель – 7-10

Бананы – 7-10

Печень – 20-50

Селезенка – 20-50

Кумыс – 20-25

Источником витамина С может быть хвоя ели и сосны, содержащая 150-250 мг% (иногда до 400 мг%) аскорбиновой кислоты.
Ход работы

а) гомогенизация биоматериала и экстракция витамина C

Взвешивают определенное количество исследуемого материала:

картофеля, банана - по 5 гр;

капусты, томата, яблока, лимона, укропа, лука – по 2 гр;

хвои – 1 гр.

Навеску измельчают ножом или ножницами, помещают в фарфоровую ступку и тщательно растирают, добавив 2 мл дистиллированной воды. Смесь количественно переносят в мерную колбочку на 25 мл, объем доводят дистиллированной водой до метки, содержимое перемешивают и через 10 минут фильтруют через бумажный фильтр.

б) количественное определение витамина С в экстракте

В две конические колбочки наливают по 10 мл фильтрата, добавляют 2-3 капли 10%-го раствора соляной кислоты и пробы титруют при постоянном помешивании из микробюретки 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд.
2. Определение количества витамина С в шиповнике

Шиповник занимает первое место среди источников витамина С. Количество аскорбиновой кислоты в шиповнике  500-1500 мг%. Плоды некоторых сортов культурного шипов-ника содержат до 2-4,5% витамина С.

Ход работы

а) Гомогенизация биоматериала и экстракция витамина С

Взвешивают 1 г околоплодника свежих ягод шиповника и далее получают фильтрат, как изложено в разделе 1.

Если анализируют сухие ягоды шиповника, то кусочки околоплодника растирают в порошок в сухой ступке. Навеску пересыпают в мерную колбочку на 25 мл, а пестик и ступку 2-3 раза обливают небольшими порциями дистиллированной воды, сливая воду в ту же колбочку. Затем объем колбочки доводят дистиллированной водой до метки, колбочку закрывают пробкой, содержимое энергично встряхивают в течение 2-3 минут и после 10-минутного стояния фильтруют через бумажный фильтр.

б) Количественное определение витамина С в экстракте шиповника

В две конические колбочки наливают по 2 мл полученного фильтрата шиповника. Добавляют по 2-3 капли 10%-го раствора соляной кислоты и по 2 мл дистиллированной воды. Пробы титруют при постоянном помешивании 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд.
3. Определение количества витамина С в моче

Определение количества аскорбиновой кислоты в моче дает представление о запасах этого витамина в организме.

В суточной моче здорового человека содержится 20-30 мг витамина С (или 113,55-170,33 мк моль/ сутки). Это количество снижается при острых и хронических инфекционных заболе-ваниях, особенно у детей.

Однако при гиповитаминозе С содержание витамина в моче не всегда понижено. Часто оно бывает нормальным, несмотря на недостачу аскорбиновой кислоты в тканях и органах. Поэтому для обнаружения гиповитаминоза С более достоверным являет-ся определение его количества в моче после витаминной нагрузки. У здоровых людей введение per os 100 мг витамина С приводит к быстрому повышению его количества в моче. При гиповитаминозе С ткани, испытывающие недостаток в вита-мине, задерживают аскорбиновую кислоту, и ее концентрация в моче не повышается.

Ход работы. В две конические колбочки отмеривают по 10 мл мочи, 10 мл дистиллированной воды и 1 мл (20 капель) 10%-го раствора соляной кислоты. Содержимое каждой колбочки перемешивают и титруют 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд.


Оформление работы

  1. Рассчитайте количество витамина С в пищевых продуктах, хвое и шиповнике по формуле:

0,088  А  25  100

Х =  ,

Б  В

где Х – содержание аскорбиновой кислоты в мг%;

0,088 – количество аскорбиновой кислоты (в мг%), эквива-лентное 1 мл 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (молекулярная масса аскорбиновой кислоты равна 176, а грамм-эквивалент – 88 г);

А – количество 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофе-нолята натрия, пошедшее на титрование (средняя арифмети-ческая двух проб в мл);

25 – общее количество вытяжки в мерной колбочке (в мл);

100 – пересчет на 100 г исследуемого материала;

Б – количество фильтрата, взятое для титрования (в мл);

В – количество исследуемого материала, взятое для анализа (в г);

Сравните полученные результаты с литературными данными.

2. Рассчитайте количество витамина С в моче по формуле:

0,088  А  В

Х = ,

Б

где Х – содержание аскорбиновой кислоты в моче (в мг/сутки);

0,088 – количество аскорбиновой кислоты, эквивалентное 1 мл 0,001 н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия (в мг);

А – средняя арифметическая результатов титрования 0,001 н раствором краски Тильманса двух проб мочи (в мл);

В – среднее суточное количество мочи (для мужчин – 1500 мл, для женщин – 1200 мл);

Б – объем мочи, взятый для титрования (в мл).

Техника безопасности

  • Осторожно обращайтесь с 10%-м раствором соляной кислоты.

  • Избегайте раздражения кожи рук семенами шиповника.



Работа 7. Определение количества глюкозы

в крови ортотолуидиновым методом

Количество глюкозы в крови является одним из основных показателей углеводного обмена. Нормальное содержание глюкозы в крови у взрослого человека довольно постоянно и колеблется от 3,33 до 5,55 ммоль/л (60-100 мг%), а в плазме крови – 3,88-6,105 ммоль/л (70-110 мг%). Количественное определение глюкозы в крови очень важно для диагностики ряда заболеваний: сахарного диабета, нарушений функций печени, почек, надпочечников, наследственных энзимопатий.

Принцип метода. Определение содержания сахара в крови по цветной реакции с ортотолуидином предложено Hulmannом. Метод основан на способности глюкозы реагировать при нагревании с ортотолуидином в растворе уксусной кислоты с образованием соединения окрашенного в сине-зеленый цвет:
O CH3

CH 

CH3 HCOH N=CH

 HOCH HCOH

NH2 + HCOH  HOCH

HCOH Н2О HCOH

CH2OH HCOH

CH2OH

о-толуидин глюкоза соединение сине-

зеленого цвета

Интенсивность окраски прямо пропорциональна концент-рации глюкозы и может быть определена колориметрически.

С ортотолуидиновым реактивом реагируют и другие альдо-гексозы, но содержание их в крови невелико, поэтому метод позволяет определить практически одну глюкозу.

Ход работы

а) Осаждение белков крови трихлоруксусной кислотой

В две центрифужные пробирки (опытную и контрольную) наливают по 0,9 мл 3%-го раствора трихлоруксусной кислоты. В опытную пробирку добавляют микропипеткой 0,1 мл крови (или сыворотки крови), а в контрольную – 0,1 мл стандартного раствора глюкозы (100 мг%). Содержимое пробирок перемеши-вают и пробы центрифугируют в течение 10 минут при 3000 об./мин.

Во избежание взмучивания осадка на следующем этапе анализа центрифугат из опытной пробирки можно осторожно переливают в сухую чистую пробирку.
б) Цветная реакция с ортотолуидином

В две сухие обыкновенные пробирки переносят по 0,5 мл центрифугата из опытной и контрольной пробы. Затем очень осторожно добавляют мерной пробиркой по 4,5 мл ортотолуи-динового реактива (работу выполняют в вытяжном шкафу с включенной тягой!). Содержимое каждой пробирки осторожно перемешивают стеклянной палочкой, пробирки закрывают кусочками фольги и помещают в бурно кипящую водяную баню точно на 8 минут. После этого пробирки охлаждают водопроводной водой до комнатной температуры.
в) Определение оптической плотности

Оптическую плотность опытной и стандартной проб измеряют на фотоэлектроколориметре с красным светофильт-ром (длина волны 670 нм) в кюветах на 10 мм против дистиллированной воды.


Оформление работы.

1. Рассчитайте количество глюкозы в исследуемой крови по формуле:

Сст х Еоп

Соп =  ,

Ест

где Соп – концентрация глюкозы в крови (в мг%);

Сст – концентрация стандартного раствора глюкозы (100 мг%);

Еоп – оптическая плотность опытной пробы;

Ест – оптическая плотность стандартной пробы.

2. Сделайте перерасчет полученного результата в единицах СИ, используя коэффициент 0,0555, так как 1 мг% концентра-ции глюкозы соответствует 0,0555 ммоль/л.

Сравните полученные результаты с нормальными показателями сахара в крови.
Техника безопасности

  • Соблюдайте особую осторожность при работе с ортотолуи-диновым реактивом, который является раствором о-толуи-дина на ледяной уксусной кислоте и вызывает сильные ожоги кожи и раздражение слизистой оболочки полости рта и носа. При работе с ортотолуидиновым реактивом необходимо использовать вытяжной шкаф с включенной тягой.

  • Соблюдайте правила работы с электронагревательными приборами.

  • Остерегайтесь ожогов паром при использовании кипящей водяной бани.

  • Соблюдайте правила работы на фотоэлектроколориметре.


Работа 8. Глюкозооксидазный метод определения глюкозы

в биологических жидкостях

Принцип метода. При окислении -D-глюкозы кислородом воздуха под действием глюкозооксидазы (GOD) образуется эквимолярное количество перекиси водорода. Под действием пероксидазы (POD) перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта. Интенсив-ность окраски пропорциональна концентрации глюкозы в пробе. Исследуемым материалом может быть свежая сыворотка или плазма крови и моча. Если глюкозу определяют в моче, следует предварительно провести качественную реакцию, и только при обнаружении положительной реакции – провести количест-венный анализ.

страница 1страница 2страница 3


скачать

Другие похожие работы: